Основа окраски Райта, материалы, техника и использование



Пятно Ригта является техникой окрашивания, созданной американским патологом Джеймсом Гомером Райтом в 1902 году из пятна Романовского. Поскольку пятно Романовского было нестабильным, Wrigth включил метанол в качестве растворителя и закрепителя.

Эта окраска является полихромной, что означает, что она генерирует несколько цветов в зависимости от структуры, которую поглощает краситель. Этот метод окрашивания широко используется для проведения дифференциального подсчета лейкоцитов и изучения морфологии эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов в периферической крови и костном мозге..

Его применение очень важно, так как аномалии могут быть обнаружены в различных клеточных линиях крови, что облегчает диагностику таких заболеваний, как лейкемия, бактериальные или паразитарные инфекции..

Возможно, это наиболее распространенные приложения, в которых используется этот метод, однако они не единственные. Это также полезно в образцах, отличных от крови и костного мозга, таких как образцы выделения из носа, фекальной слизи, мокроты, кожи и других..

индекс

  • 1 основание окраски Райта
  • 2 Материалы
    • 2.1 Подготовка
    • 2.2 Буферный буферный раствор
    • 2.3 Дополнительные материалы, необходимые для выполнения окраски
  • 3 компонента окраски Райта
    • 3.1 Метанол
    • 3.2 Амортизатор
    • 3,3 Эозин (Y)
    • 3.4 Метиленовый синий
  • 4 Техника
  • 5 Полезность
    • 5.1 Гематология
    • 5.2 Носовая секреция
    • 5.3 Паразитология
    • 5.4 Респираторные инфекции
    • 5.5 Бактериология
    • 5.6 Микология
  • 6 Как структуры образца крови наблюдаются с пятном Райта??
  • 7 рекомендаций по хорошему окрашиванию
  • 8 распространенных ошибок в раскраске Wrigth
    • 8.1 Очень бледное окрашивание
    • 8.2 Осадки красителя
    • 8.3 Мазок с чрезвычайно красноватой или синей окраской
  • 9 Режим хранения
  • 10 ссылок

Пятно фонда Райта

Пятно Райта родилось от пятна Романовского, которое состоит из раствора метилового спирта из кислотного красителя (эозина Y) и основного (метиленового синего) и продуктов его окисления..

Смесь красителей, используемых в пятне Райта, вызывает эффект, известный как Романовский, то есть он обеспечивает красивую пурпурную окраску ядер лейкоцитов и нейтрофильных гранул, в то время как красные кровяные клетки окрашены в розовый цвет..

Компоненты, ответственные за предоставление цветовой гаммы, типичной для окраски Райта, - это синий B и эозин Y. Наблюдаемый эффект будет зависеть от связывания красителей с химической структурой и взаимодействия синего B и эозина Y.

Кислотные структуры, такие как нуклеиновые кислоты, ядерные белки и реактивная незрелая цитоплазма некоторых типов клеток, фиксируют синий B (основной краситель).

В то время как основные структуры, такие как гемоглобин, гранулы сегментированных эозинофилов, среди других клеточных структур, фиксируют эозин Y (кислотный краситель).

На результат окрашивания могут влиять различные факторы, такие как рН красителя Райта, буфер и промывочный раствор; а также время окрашивания и фиксации.

Таким образом, каждый шаг в приготовлении реагентов имеет решающее значение и должен быть сделан с учетом каждой детали.

материалы

Райт окраски. Для 100 мл требуется:

Взвесить 0,3 г красителя Райта, отмерить 97 мл метанола и 3 мл глицерина..

подготовка

В ступку поместите большое количество красителя Райта и медленно добавляйте глицерин до полного растворения порошка..

Затем метанол добавляют, смешивают и разливают в янтарную бутылку..

Перед использованием раствор следует встряхнуть легкими движениями и процедить.

Буферный буфер

В литре дистиллированной воды 3,76 г гидрофосфата динатрия (Na2HPO4   2H20) плюс 2,1 г дигидрофосфата калия (KH)2ПО4).

Очень хорошо перемешайте, пока все включенные реагенты не растворится. Отрегулируйте рН до 7,2. Разлить в стеклянную банку и хранить при комнатной температуре..

Дополнительные материалы, необходимые для выполнения окраски

Кроме того, для выполнения техники окрашивания требуются другие материалы: листы с предметами или накрывающими предметами, мостик для окрашивания, салфетки с водой или буфером для стирки, секундомер для нанесения краски и немного сушильного материала. (гигроскопическая бумага, марля или хлопок).

Компоненты окраски Райта

метанол

Алкоголь (метанол) служит фиксатором мазка крови на предметном стекле.

В основном это восстанавливающий реагент, дегидратор и коагулянт. Следовательно, его функция состоит в том, чтобы коагулировать белки и делать их нерастворимыми, но без возможности их денатурировать.

Метанол является наиболее широко используемым реагентом для фиксации мазков во всех лабораториях, поскольку он дает лучшие результаты, чем результаты, полученные с помощью этанола. Идеальная концентрация составляет 99%.

Амортизатор

Буфер (забуференный раствор) выполняет функцию регулировки или поддержания рН красителя, поскольку рН, доведенный до 7,2, необходим для правильной абсорбции красителей клеточными структурами..

С другой стороны, прохождение фиксации метанола приводит к дегидратации клеток, а буфер помогает их регидрировать..

Эозин (Y)

Эозин имеет сродство к основным компонентам, потому что это кислотный краситель. Два типа эозина очень похожи друг на друга, поэтому можно использовать любой из двух, получая одинаковый результат.

Один называется эозином Y, желтым эозином или тетрабромфлуоресцеином, а другой - эозином В, синеватым эритрозином В или дибромодинитрофлуоресцеином. Тем не менее, эозин Y является наиболее часто используемым.

Наиболее важным свойством этого красителя является его отрицательная полярность, что делает его привлекательным для клеточных структур с положительным зарядом.

Метиленовый синий

Это основная расцветка. Его основным свойством является метахромазия, то есть не все структуры будут окрашиваться в один цвет, это зависит от химического состава окрашиваемых структур..

Некоторые станут светло-или темно-синими, а другие темно-фиолетовыми или бледно-лиловыми.

техника

1-Распределите образец так, чтобы осталась тонкая пленка на предметном стекле или покровном стекле..

2-Дайте воздуху высохнуть в течение 2 часов.

3-Поместите сухой мазок на окрашивающую перемычку или поддон для окрашивания, распределяя образец вверх..

4-Покройте лист краской Райта по каплям, пока он не покроет всю поверхность. Оставить на 5-8 минут.

5-Краситель должен полностью покрывать слайд, не проливая на края. Если во время окраски он начинает испаряться, следует поместить дополнительные капли.

6-Впоследствии добавьте равное количество амортизатора, немного подуйте, пока не появится характерный металлический блеск. Займет от 10 до 15 минут.

7-стирка с водопроводной водой, поместив мягкую струю, пока лист не станет розовым.

8 - С помощью марли, пропитанной спиртом, удалите краситель, прикрепленный к задней части предметного стекла.

9-Позвольте мазку очень хорошо высохнуть, прежде чем помещать иммерсионное масло, чтобы визуализировать его в микроскоп.

утилита

гематология

Идеально подходит для смазывания мазков периферической крови, для исследования мазков густой крови и для исследования клеток из образцов костного мозга.

Благодаря химическим свойствам этой комбинации красителей клеточные структуры могут быть легко распознаны, что позволяет различать различные типы присутствующих клеток..

Носовая секреция

Эта методика очень полезна для выявления клеток носовой секреции (эпителиальных клеток, сегментированных эозинофилов, полиморфноядерных) при диагностике аллергического ринита.

паразитология

В этом смысле это было полезно для изучения Leishmania sp в гистиоцитах подкожной клетчатки в кожных язвах. Кроме того, он используется для идентификации лейкоцитов в образцах стула (фекальная лейкограмма).

В этом случае врачу интересно знать, является ли лейкоцитоз, присутствующий в кале, полиморфноядерным или мононуклеарным. Этот вывод в фекальной лейкограмме поможет определить, является ли это бактериальной или вирусной инфекцией соответственно..

С другой стороны, паразиты, которые циркулируют в крови, могут быть найдены внутри эритроцита или свободно в плазме. Разыскиваемые паразиты Plasmodium spp, Trypanosoma cruzii и филярии, а в ветеринарии это полезно при поиске Theileria equi и Бабезия Кабальи, возбудители младенцев, особенно у лошадей.

Пятно Райта и Гимзы может дифференцировать гемопаразиты от нормальных клеточных компонентов. Для этого вы можете использовать два типа спредов:

Прекрасные участки

Кровь распространяется как тонкая пленка на слайде. Окрашено окраской Райта, раскрывая характеристики ядра и цитоплазмы.

Толстая капля

Эта методология используется для изучения наличия паразитов в большем количестве крови.

Для этого на слайд помещают большую каплю крови. Оказавшись там, вы должны дефибринировать, делая все больше и больше кругов от центра наружу, используя край другого слайда.

Наконец, чтобы наблюдать паразитов в густом мазке, эритроциты необходимо лизировать водой.

Респираторные инфекции

На дыхательном уровне этот метод также полезен, потому что клетки, присутствующие в образцах мокроты, бронхиального или бронхоальвеолярного лаважа, важны для установления диагноза..

Аналогично, полиморфно-ядерные клетки и мононуклеарные клетки можно различить здесь.

бактериология

Использование этого метода в бактериологии ограничено, так как он не подходит для окрашивания бактерий, поэтому для окрашивания их используются другие специализированные методы окрашивания..

Тем не менее, он был использован для поиска эпителиальных клеток с включением тел Chlamydia trachomatis в мазках слизистой уретры или эндоцервикальной области, хотя следует признать, что это не лучший метод для этого.

Можно также наблюдать бактерии спирального типа среди эритроцитов как Borrelia burgdorferi у инфицированных пациентов, а также морул или тел включения Эрлихия С.П. в цитоплазме лимфоцитов, моноцитов или нейтрофилов в мазке крови.

микология

Histoplasma capsulatum является патогенным грибком, часто диагностируемым при микроскопическом исследовании различных образцов ткани, окрашенных пятном Райта.

Как структуры образца крови наблюдаются с пятном Райта?

Рекомендации по хорошему окрашиванию

Расширения образцов крови должны быть высушены на воздухе самопроизвольно. Мазки должны быть как можно более тонкими, чтобы обеспечить лучшую фиксацию красителя и избежать чрезмерного окрашивания.

Для качественного окрашивания рекомендуется проводить окрашивание в течение двух часов после приготовления мазка. С другой стороны, идеальным образцом является капиллярная кровь без антикоагулянта.

Однако, если используется венозная кровь, ее следует использовать в качестве антикоагулянта ЭДТА, а не гепарина, поскольку последний может деформировать клеточные структуры.

Для предотвращения порчи приготовленный краситель следует хранить в сухих местах.

В процессе стирки рекомендуется использовать воду с нейтральным pH..

Наконец, желательно проверить методы окрашивания, которые используются в лаборатории очень часто.

Это делается путем окрашивания образцов или расширенных образцов в качестве контроля качества. Этот шаг важен, так как он гарантирует, что окрашивание правильно подготовлено, а время окрашивания хорошо стандартизировано..

Если лист шаблона плохо окрашен, то есть проблемы, которые необходимо решить.

Распространенные ошибки в раскраске Wrigth

Очень бледное окрашивание

Очень бледные мазки, как правило, из-за очень короткого времени окрашивания или очень преувеличенной стирки. Это корректируется путем увеличения времени контакта с красителем или уменьшения времени стирки.

Краситель выпадает в осадок

Наличие осаждения красителя в мазке может иметь несколько причин, однако наиболее частыми причинами являются: использование нефильтрованного красителя, окрашивание неровных окрашивающих мостов, использование грязных листов с пылью или жиром, плохая стирка при Закончить окрашивание.

Мазок с чрезвычайно красноватой или синей окраской

Буфер отвечает за pH красителя. Красители с pH ниже указанного (кислота) приведут к очень красным мазкам.

Если pH красителя выше (щелочного), будет получен чрезвычайно голубоватый мазок.

Режим хранения

Реагент следует хранить при комнатной температуре.

ссылки

  1. Гутьеррес В. Сравнительное исследование между методом окрашивания Райта и тестом Элизы для диагностики Ehrlichiosis canina в городе Сан-Педро-Сула, Гондурас. 2008. Диссертация на соискание ученой степени ветеринарного врача. Университет Сан-Карлос-де-Гватемала.
  2. Лопес-Жаком Л, Эрнандес-Дуран М, Колин-Кастро С, Ортега-Пенья С., Керон-Гонсалес Г., Франко-Сендехас Ф. Базовое окрашивание в лаборатории микробиологии. Исследования по инвалидности. 2014; 3 (1): 10-18.
  3. "Пятно Райта." Википедия, Свободная энциклопедия. 18 мая 2018, 12:05 UTC. 8 декабря 2018 года, 20:37
  4. Кальдерон A, Кардона J, Вергара Ó. Частота Babesia spp. у лошадей Монтерии, Кордова (Колумбия). Преподобный.  2013; 16 (2): 451-458.
  5. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Микробиологическая диагностика Бэйли и Скотта. 12 изд. Аргентина. Panamericana S.A Редакция.
  6. Retamales E, Mazo V. Институт общественного здравоохранения Правительство Чили. Рекомендации по окрашиванию мазков крови для считывания показателей крови.