Основа, методы и способы окрашивания спор



окрашивание спор методология, используемая для окрашивания структур устойчивости, которые образуют некоторые бактериальные роды, когда они находятся в неблагоприятных условиях; эти структуры соответствуют способу выживания.

Есть много родов, которые образуют споры; Однако основными из них являются Bacillus и Clostridium. Эти роды считаются более актуальными, потому что они имеют патогенные виды для людей.

Каждая бацилла может породить спору. Во время окрашивания препарата спора может быть найдена внутри бациллы (эндоспора) или снаружи (экзоспора). При использовании традиционных методов окрашивания бактерий, таких как окрашивание по Граму, споры остаются бесцветными..

В настоящее время существует несколько методик окраски, которые способны пересекать толстую структуру споры и окрашивать ее. Эти методологии очень разнообразны; среди них можно упомянуть технику Дорнера, мельеровскую окраску и методологию Шеффера-Фултона, также известную как Вирц-Конклин..

Из всех упомянутых методик методология Шеффера-Фултона является наиболее используемой в рутинных лабораториях. Он обязан своим именем двум микробиологам, создавшим окраску в 1930 году: Алисии Шеффер и Макдональду Фултону. Однако иногда эту технику называют Вирц-Конклин в честь двух бактериологов 1900-х годов..

индекс

  • 1 фундамент
  • 2 Техника окраски спор
    • 2.1 Техника Дорнера
    • 2.2 Модифицированная техника Дорнера
    • 2.3 Техника Шеффера-Фултона или Вирца-Конклина
    • 2.4 Техника Мёллера
    • 2.5 Модифицированная техника Мёллера без нагрева
  • 3 использования
    • 3.1 Примеры
  • 4 Ссылки

фундамент

Споры не окрашиваются обычными окрасками, потому что имеют очень толстую стенку. Сложный состав спор предотвращает проникновение большинства красителей.

Если споры изучаются снаружи внутрь, наблюдаются следующие слои: во-первых, экзоспорий, который является самым тонким наружным слоем, образованным гликопротеинами..

Затем следует кутикула, которая обеспечивает устойчивость к высоким температурам, за которой следует кора, состоящая из пептидогликана. Тогда есть стена основания, которая защищает протопласт.

Спора представляет собой обезвоженную структуру, которая содержит 15% кальция и дипиколиновой кислоты. Поэтому большинство методов окрашивания спор основаны на применении тепла, чтобы краситель мог проникать в толстую структуру..

Как только спора окрашена, она не может устранить краситель. В методике Шеффера-Фултона малахитовый зеленый проникает в вегетативные клетки и при воздействии тепла проникает в эндоспоры, а также в экзоспоры..

При промывании водой краситель удаляется из вегетативной клетки. Это происходит потому, что зеленый малахитовый краситель является слегка основным, поэтому он слабо связывается с вегетативной клеткой.

С другой стороны, он не может выйти из споры, и, наконец, контрастирует бацилла с сафранином. Эта основа действительна для остальных техник, в которых происходит нечто подобное.

Техника окраски спор

Чтобы споры окрасились, у вас должна быть чистая культура подозреваемого штамма, которую вы хотите изучить.

Культура подвергается воздействию экстремальных температур в течение 24 часов, чтобы стимулировать микроорганизм к споруляции. Для этого культуру можно поместить в духовку при 44 ° С или в холодильник (8 ° С) на 24 или 48 часов..

Если при указанных температурах останется слишком много времени, будут наблюдаться только экзоспоры, поскольку все эндоспоры покинут бациллу..

В конце времени, несколько капель стерильного физиологического раствора должны быть помещены на чистое предметное стекло. Затем берется небольшая часть урожая и производится мелкий спред. 

После этого его оставляют сохнуть, его фиксируют на высокой температуре и окрашивают некоторыми методами, которые описаны ниже:

Техника Дорнера

1- Приготовьте в пробирке концентрированную суспензию спорулированного микроорганизма в дистиллированной воде и добавьте равный объем отфильтрованного Kinyoun фенольного фуксина.

2- Поместите пробирку в ванну с кипящей водой на 5-10 минут..

3- На чистом предметном стекле смешайте каплю предыдущей суспензии с каплей 10% водного раствора нигрозина, вскипятите и отфильтруйте.

4- быстро растягивается и сохнет при умеренном нагревании.

5- Исследуйте с 100X объективом (погружение).

Споры окрашиваются в красный цвет, а бактериальные клетки выглядят почти бесцветными на темно-сером фоне.

Модифицированная техника Дорнера

1- Суспензия спорулированного микроорганизма распределяется на предметном стекле и фиксируется на высокой температуре..

2- Образец покрывается полоской фильтровальной бумаги, к которой добавляется фуксин фениновой кислоты. Краситель нагревают в течение 5-7 минут с помощью пламени горелки Бунзена до тех пор, пока не образуются выделения паров. Затем бумага удаляется.

3- Вымойте препарат водой, а затем высушите с помощью впитывающей бумаги..

4- Покройте мазок тонкой пленкой из 10% нигрозина, используя второе предметное стекло, чтобы распределить нигрозин или иглу.

Окраска, полученная спорами и бактериями, такая же, как описанная в предшествующем уровне техники..

Техника Шеффера-Фултона или Вирца-Конклина

1- Сделайте тонкий спред с суспензией спорулированного микроорганизма на предметном стекле и закрепите его для нагревания..

2- Накройте предметное стекло водным раствором 5% малахитового зеленого (на листе можно разместить фильтровальную бумагу).

3. Нагрейте пламя горелки Бунзена, чтобы пар вышел и удалял пламя. Повторите операцию от 6 до 10 минут. Если во время процедуры малахитовый зеленый раствор испаряется слишком много, можно добавить еще.

4- Удалите фильтровальную бумагу (если она была размещена) и промойте водой.

5- Накройте предметное стекло 0,5% водным сафранином в течение 30 секунд (в некоторых вариантах техники используется 0,1% водный сафранин и оставьте его на 3 минуты).

С этой техникой споры зеленые и бациллы красные.

Недостатком является то, что эндоспоры молодых культур плохо окрашиваются, так как выглядят очень прозрачными или бесцветными. Чтобы избежать этого, рекомендуется использовать культуры 48 часов инкубации.

Техника Мёллера

1- Покройте мазок хлороформом в течение 2 минут..

2- Откажитесь от хлороформа.

3- Покройте 5% -ной хромовой кислотой в течение 5 минут.

4- промыть дистиллированной водой

5- Лист покрыт фуксин-фенольным карпом и подвергается воздействию пламени горелки Бунзена до момента выделения паров; затем он удаляется из пламени на несколько мгновений. Операция повторяется до 10 минут.

6- мыть водой.

7- Используйте подкисленный этанол (соляной спирт) для обесцвечивания. Осталось на 20 или 30 секунд.

8- Промыть дистиллированной водой.

9- Противодействовать покрытию листа метиленовым синим в течение 5 минут..

10- Промыть дистиллированной водой.

11 - Осталось высохнуть, и образец взят под микроскопом..

Споры выглядят красными и синими бациллами. Важно не вдыхать пары, потому что они токсичны и в долгосрочной перспективе могут быть канцерогенными.

Модифицированная техника Мёллера без тепла

В 2007 году Хаяма и его сотрудники создали модификацию метода Мёллера. Они удалили этап нагревания красителя и заменили его добавлением 2 капель поверхностно-активного вещества Tergitol 7 на каждые 10 мл фуксин-фенольного карболического раствора. Те же результаты были получены.

приложений

Окраска спор предоставляет очень ценную и полезную информацию для идентификации возбудителя, так как наличие его, его форма, расположение в бацилле и способность деформировать вегетативную клетку или нет, являются данными, которые могут направлять вид участвует в определенном поле.

В этом контексте стоит упомянуть, что споры могут быть круглыми или овальными, они могут располагаться в центре или также в парацентральном, субтерминальном или терминальном положении.

примеров

- Clostridium difficile образует овальную спору в терминальном положении, которая деформирует бациллу.

- Спора Clostridium Tertium Он овальный, не деформирует бациллу и расположен на уровне терминала.

- Эндоспора Clostridium тетэни он терминальный и деформирует палочку, придавая вид голени.

- Споры Clostridium botulinum, С. histolyticum, С. Новый и C. septicum они округлые или субтерминальные овальные и деформируют бациллу.

- Эндоспора Clostridium sordelli он расположен в центральном положении, с небольшой деформацией.

ссылки

  1. Хаяма М, Оана К, Козакай Т, Умеда С., Фуджимото Дж., Ота Х, Каваками Й. Предложение упрощенной методики окрашивания бактериальных спор без применения термически успешной модификации метода Мёллера. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
  2. Участники Википедии. Пятно меллера. Википедия, Свободная энциклопедия. 3 ноября 2018 года, 03:28 UTC. Доступно по адресу: en.wikipedia.org
  3. Перес Р., Хуарес М., Родригес (2011). Лабораторное руководство по микробиологической технике. Отделение фундаментальных наук Академии микробиологии. Национальный политехнический институт.
  4. «Эндоспоровый.» Википедия, Свободная энциклопедия. 25 февраля 2018, 10:20 UTC. 10 января 2019 года, 02:42: en.wikipedia.org
  5. Сильва Л, Сильва С, Фернандес Н, Буэно С, Торрес Дж, Рико М, Макиас Ж и соавторы. (2006). Трудовой персонал автономного сообщества Эстремадура. Конкретная повестка дня Том IV. Редакция MAD. Севилья-Испания, стр. 211-212.
  6. Сильва М., Гарсия М., Корралес Дж., Понсе Е. (2006 г.), специалист-лаборант Галицкой службы здравоохранения (СЕРГАС). Тематика конкретного тома 2. Редакция MAD. Севилья-Испания, стр. 79-80.
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологический диагноз. (5-е изд.). Аргентина, редакция Panamericana S.A..
  8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Микробиологическая диагностика Bailey & Scott. 12 изд. Аргентина. Panamericana S.A Редакция