Agar Müeller Hinton фонд, подготовка и использование



Мюллер Хинтон Агар Это твердая неселективная питательная среда, состоящая из мясного настоя, пептона казеиновой кислоты, крахмала, агара и дистиллированной воды. Эта среда обеспечивает отличное микробное развитие наиболее быстро растущих бактерий..

Первоначально он был создан Джоном Говардом Мюллером и Джейн Хинтон для изоляции питательных бактерий, таких как Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitidis. Однако благодаря своим характеристикам он оказался идеальным для изучения чувствительности к антибиотикам, обеспечивая надежные и воспроизводимые результаты..

По этой причине агар Мюллера Хинтона является культуральной средой, принятой Институтом клинических и лабораторных стандартов (CLSI) и Европейским комитетом по тестированию антимикробной чувствительности, для проведения теста на антимикробную чувствительность методом диффузии дисков Кирби. Bauer.

индекс

  • 1 фундамент
  • 2 Подготовка
  • 3 использования
    • 3.1 Антимикробная техника
    • 3.2 Стратегическое размещение дисков на агаре Мюллера Хинтона
  • 4 Причины ошибочных результатов
  • 5 Ограничение
  • 6 Контроль качества
  • 7 ссылок

фундамент

Поскольку это неселективная питательная среда, она отлично подходит для роста большинства патогенных бактерий..

С другой стороны, его простой состав делает вещества легко диффундирующими на нем, что является важной характеристикой для теста на восприимчивость методом диффузии на диске..

Другая его особенность заключается в том, что он содержит небольшое количество ингибиторов, что позволяет эффективно оценивать сульфонамиды, триметоприм и тетрациклины..

Однако следует учитывать, что среда должна удовлетворять определенным условиям для обеспечения ее надлежащего функционирования, в том числе:

Регулировка рН, глубина агара и адекватная концентрация тимина, тимидина, Са++, мг++ и Zn++.

Мы также должны знать, что методология стандартизирована и, следовательно, должны быть соблюдены все параметры, такие как:

Концентрация инокулята, концентрация и сохранение антибиотических дисков, размещение на агаре соответствующего количества дисков, расстояние между дисками и другим, стратегическое размещение определенных антибиотиков, атмосфера, температура и время инкубация.

подготовка

Взвесить 37 г обезвоженной среды Мюллера-Хинтона и растворить в 1 л дистиллированной воды. Нагрейте среду при перемешивании, чтобы растворить ее. Пусть кипятят 1 минуту.

Возьмите автоклав для стерилизации при 121 ° С в течение 15 минут. При извлечении из автоклава фиолу следует поместить в водяную баню при температуре 50 ° С для охлаждения. Налейте 25-30 мл в стерильные чашки Петри диаметром 10 см..

Пластины должны иметь среднюю толщину 4 мм (идеально) с допустимым диапазоном 3-5 мм..

Если необходимо приготовить кровяной агар с использованием агара Мюллера Хинтона, 5% стерильную и дефибринированную кровь ягненка переливают перед подачей на чашки..

Конечный pH среды должен составлять от 7,2 до 7,4..

Инвестируйте и храните в холодильнике до использования. Разрешить пластине принять комнатную температуру перед использованием.

Цвет приготовленной среды - светло-бежевый..

приложений

Он используется для проведения теста на восприимчивость к антибиограмме или антибиотикам для большинства быстрорастущих патогенов..

Если агар дополнен кровью, он служит для выполнения антибиограммы требовательных микроорганизмов, таких как: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp., Neisseria meningitidis, среди других. Он также был использован для изоляции Legionella pneumophila.

Техника антибиограммы

Перед выполнением антибиограммы необходимо приготовить бактериальный раствор, эквивалентный 1,5 х 10.8 клетка.

Для этого от 3 до 4 колоний отбирают из чистой культуры и суспендируют в триптиказном соевом бульоне или в бульоне Мюллера-Хинтона, инкубируют в течение 2-6 часов и концентрацию корректируют стерильным физиологическим раствором, сравнивая его со стандартом Mac Farland. 0,5%.

Если они требуют микроорганизмов, колонии могут быть приостановлены непосредственно, пока они не достигнут концентрации 0,5% Mac Farland. Затем на пластину Мюллера Хинтона замачивают тампоном, пропитанным приготовленным бактериальным раствором..

Для этого опустите тампон в раствор, а затем удалите излишки жидкости, прижавшись к стенкам трубки. Сразу после того, как тампон пройден по всей поверхности, не оставляя нетронутых участков, затем слегка поверните пластину и заново высейте. Операция повторяется еще 2 раза.

Дайте постоять 10 минут, а затем поместите диски с антибиотиками стерильными щипцами, оставив пространство между ними 24 мм. После размещения каждого диска на агаре слегка прижмите каждый из них зажимом, чтобы убедиться, что они хорошо прилипли.

После окончания процесса планшет переворачивают и инкубируют при 35-37 ° С при аэробиозе в течение 16-18 часов. Если это требовательный микроорганизм, может потребоваться микроаэрофилия, и если антибиограмма содержит диски с оксациллином, ее следует прочитать через 24 часа..

Линейка используется для измерения диаметра каждого гало. Результаты должны быть записаны в мм. Впоследствии полученные значения соотносятся с таблицами точек среза, опубликованными в текущем руководстве CLSI..

Сообщите как чувствительный (S), промежуточный (I) или устойчивый (R), в зависимости от обстоятельств.

Антибиотики выбираются в соответствии с выделенным микроорганизмом и типом возникающей инфекции.

Иногда стратегическое размещение антибиотиков должно отражать фенотипические паттерны резистентности..

Стратегическое размещение дисков на агаре Мюллера Хинтона

Для энтеробактерий диск с клавулановой кислотой должен быть помещен перед цефалоспоринами 3-го и 4-го поколения. Расширение в форме яйца указывает на то, что штамм является продуцентом бета-лактамаз расширенного спектра (ESBL). Это означает, что пациент не должен лечиться никаким цефалоспорином.

При стафилококке важно поместить диск с эритромицином или азитромицином перед диском с клиндамицином (D-тест).

Устойчивый гало в эритромицине и уплощение в гало клиндамицина указывает на то, что штамм обладает индуцибельной устойчивостью к клиндамицину, штамм (RIC). Это означает, что лечение клиндамицином не будет эффективным.

Для поиска индуцибельных штаммов AMP C в Enterobacteriaceae и некоторых неферментирующих грамотрицательных бациллах диски с цефтазидимом, цефокситином или пиперациллином тазобактаном сталкиваются с диском имипенема на расстоянии 27 мм..

Ореол, сплющенный в одном из дисков, обращенных к имипенему, указывает на присутствие индуцибельного AMP C.

Для поиска конститутивного AMP C диск с клоксациллином в 500 мкг сталкивают с цефтазидимом (30 мкг) и с цефотаксимом (30 мкг) на расстоянии 25 мм. Расширенный ореол в одном из цефалоспоринов указывает на позитивность.

Диск клоксациллина также можно заменить на 9 мм диск из фильтровальной бумаги Whatman № 6, пропитанный фенилбороновой кислотой (400 мкг), на расстоянии 18 мм. Интерпретируется так же, как и предыдущий.

Наконец, для изучения производства металло-бета-лактамаз, особенно в Pseudomonas aeruginosa, диск, пропитанный 10 мкл этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA 750 мкг) и тиогликолевой кислоты (SMA 300 мкг), который обращен к дискам имипенема и меропенема, используется на расстоянии 15 мм..

Тест положительный, если имеется расширение ореолов имипенема или меропенема в направлении диска EDTA / SMA. Этот результат должен быть подтвержден модифицированным тестом Ходжа.

Этот метод заключается в прививке штамма Кишечная палочка ATCC 25922 на табличке Мюллера Хинтона. Имипенемный диск помещают в центр пластины, а затем из диска к периферии делают канавку с деформацией P. aeruginosa подозрительный. Вы можете проверить до 4 штаммов на пластину.

Тест будет положительным, если вокруг стрии будет зона искажения ореола имипенема..

Причины ошибочных результатов

-Диски с плохо сохранившимися антибиотиками могут вызывать ложное сопротивление. Например, диск из оксациллина очень чувствителен к изменениям температуры.

-Значение pH среды ниже указанного (кислоты) приводит к образованию меньших ореолов в аминогликозидах и макролидах (риск ложной резистентности) и больших ореолов в пенициллине, тетрациклине и новобиоцине (риск ложной чувствительности).

-Если pH выше указанного (щелочного), эффекты, описанные выше, меняются местами..

-Среды с высокими концентрациями тимина и тимидина оказывают существенное влияние на снижение гало ингибирования сульфонамидов и триметоприма.

-Высокие концентрации кальция и магния вызывают ложную устойчивость аминогликозидов, полимиксина B и тетрациклинов к штаммам Pseudomonas aeruginosa.

-Низкие концентрации кальция и магния вызывают ложную чувствительность аминогликозидов, полимиксина B и тетрациклинов к штаммам Pseudomonas aeruginosa.

-Присутствие цинка влияет на результаты работы карбапенемных дисков (имипенем, меропенем и эртапенем).

-Толщина среды ниже 3 мм дает ложные результаты чувствительности, в то время как толщина выше 5 будет давать ложные сопротивления.

-Мобилизация дисков на антибиограмме даст деформированные ореолы, так как выброс антибиотика происходит немедленно.

- Очень слабые инокуляты влияют на результаты, так как в агаре не будет равномерного или слитого роста, что является необходимым условием для измерения зон ингибирования, в дополнение к тому факту, что гало могут давать больше, чем обычно..

-Перегруженная инокулят может дать ореолы меньше, чем обычно.

-Несоблюдение расстояния между дисками приводит к тому, что один ореол перекрывает другой и не может быть правильно прочитан.

-Инкубировать с СО2 увеличивает размер ореолов тетрациклиновых и метициллиновых дисков.

-Инкубация при температуре ниже 35 ° C приводит к образованию более крупных ореолов.

-Добавление крови уменьшает размер гало сульфонамидов.

ограничение

Чувствительность антибиотика, продемонстрированная на антибиограмме против микроорганизма (в пробирке) не является гарантией того, что это будет работать в естественных условиях.

Контроль качества

Чтобы узнать, содержит ли среда нужное количество тимина, следует высеять штамм. Enterococcus faecalis ATCC 29212 и проверить чувствительность к триметоприму сульфаметоксазолу (SXT), он должен дать значение гало, равное или> 20 мм, чтобы быть удовлетворительным.

ссылки

  1. «Агар Мюллер-Хинтон». Википедия, Свободная энциклопедия. 16 ноября 2018 года, 12:23 UTC. 27 января 2019 г., 04:22
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологическая диагностика Бэйли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana S.A. Аргентина.
  3. Кона Э. Условия для хорошего исследования восприимчивости с помощью агар-диффузионного теста. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
  4. Дифко Франциско Сория Мелгуизо Лаборатория. Агар Мюллера Хинтон с 5% овечьей крови. 2009. Доступно по адресу: http://f-soria.es
  5. Б. Д. Мюллер Хинтон II Агаровая лаборатория. 2017. Доступно по адресу: .bd.com
  6. Лаборатории Британии. Мюллер Хинтон Агар. 2015. Доступно по адресу: britanialab.com
  7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологический диагноз. 5-е изд. Редакция Panamericana S.A. Аргентина.
  8. Мартинес-Рохас Д. Betalactamasas типа AmpC: общее и методы фенотипического выявления. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Доступно по адресу: scielo.org.
  9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Фенотипическое обнаружение металлобеталактамаз в клинических изолятах Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Доступно по адресу: scielo.org.