ДНК-секвенирование Максама-Гилберта, метод Сангера, примеры



Секвенирование ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) - это процедура, выполняемая в лабораториях молекулярной биологии, которая позволяет узнать порядок нуклеотидов в интересующем генетическом материале. Кроме того, секвенирование РНК (рибонуклеиновая кислота) также может быть выявлено.

Эта техника была необходима для развития биологических наук. Это также применимо к другим областям знаний, таким как, например, медицинская диагностика и судебно-медицинская экспертиза..

Ранее секвенирование цепи ДНК считалось медленной и дорогой активностью, которая позволяла идентифицировать только несколько пар оснований в олигонуклеотидах..

В настоящее время, при всех достижениях науки, секвенирование ДНК является обычной операцией во многих лабораториях по всему миру благодаря вкладу почти 50 лет исследований в этой области. Что касается длины цепочки, вы можете упорядочить до миллионов пар оснований за очень короткое время.

Для этого разработаны десятки методов, которые различаются по цене и точности. В этой статье мы опишем как классические, так и современные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки..

До настоящего времени методы секвенирования позволяют получить последовательность полных геномов, от небольших прокариот и дрожжей до генома человека..

индекс

  • 1 Структура ДНК
  • 2 История
  • 3 метод Сэнгера
    • 3.1 Основные компоненты реакции
    • 3.2 Чтение результатов
  • 4 Автоматическая последовательность
  • 5 секвенирование Максама-Гилберта
    • 5.1 Процедура
    • 5.2 Чтение результатов
  • 6 Массивная последовательность
    • 6.1 Пиросеквенирование
    • 6.2 Секвенирование по синтезу
    • 6.3 Секвенирование путем лигирования
    • 6.4 Секвенирование ионного торрента
  • 7 примеров
    • 7.1 Секвенирование человеческого генома
  • 8 Важность и приложения
  • 9 Ссылки

Структура ДНК

Чтобы понять методы и приемы, используемые для секвенирования ДНК, необходимо знать некоторые ключевые аспекты структуры и состава молекулы..

ДНК - это биомолекула, встречающаяся во всех живых организмах, от бактерий до крупных водных животных. Органеллы - как митохондрии и хлоропласты - имеют внутри кольцевую молекулу ДНК. Даже в некоторых вирусах обнаружен генетический материал ДНК.

Структурно ДНК представляет собой набор нуклеотидов. Каждый из них объединен углеводом, азотистым основанием (А, Т, С или G) и фосфатной группой. Целью секвенирования ДНК является выявление порядка, в котором четыре азотистых основания находятся в последовательности.

история

В середине 1950-х годов исследователи Уотсон и Крик описали структуру ДНК, используя христологические методы. Однако ни один из этих исследователей не смог найти способ раскрыть последовательность.

Хотя были некоторые предшественники, самым важным событием было создание метода Сэнгера в 1977 году. Отец метода Фредерик Сэнгер был британским биохимиком, лауреатом двух Нобелевских премий за его огромный вклад в биологические науки..

Этот метод также известен в литературе как «обрыв цепи» или дидезоксинуклеотиды. Далее мы опишем принципы этой техники и те, которые были разработаны на основе улучшения и инноваций этого.

Метод Сэнгера

Развитие метода Сэнгера стало важным событием в молекулярной биологии. Он включает в себя основные компоненты процесса репликации ДНК, который обычно происходит в клетке, но путем добавления специального компонента: дидезоксинуклеотидов.

Основные компоненты реакции

- ДНК-полимераза: фермент ДНК-полимераза является важнейшим элементом процесса. Эта молекула участвует в репликации цепи ДНК, и ее роль заключается в синтезе новой цепи, сопоставляя трифосфат дезоксирибонуклеотидов с комплементарными..

Помните, что в ДНК тимины (T) соединены с аденинами (A) посредством двух водородных связей, а цитозин (C) - с гуанином (G) тремя мостиками..

- Нуклеотиды: секвенирование Сэнгера включает два типа нуклеотидов: четыре 2'-дезоксинуклеотида (сокращенно dATP, dGTP, dCTP и dTTP) и четыре дидезоксинуклеотида (ddATP, ddGTP, ddCTP и ddTTP).

Хотя дидезоксинуклеотиды похожи на мономеры, которые обычно включены в ДНК, в их структуре отсутствует группа -ОН. Это делает невозможным добавление нового нуклеотида в цепь.

Поэтому, когда специальный нуклеотид добавляется - совершенно случайным образом - к формирующейся цепи, синтез парализуется. Таким образом, в конце реакции, есть цепи разных размеров, каждая из которых, где реакция была остановлена ​​в другой точке.

Экспериментально подготовлено четыре испытания. Каждый содержит ДНК, извлеченную из представляющего интерес биологического образца, нормальные нуклеотиды и один из четырех типов специальных нуклеотидов. Или специальные нуклеотиды помечены каким-то типом флуоресцентного маркера (см. Ниже автоматическое секвенирование).

Чтение результатов

Первым шагом является разделение каждой из синтезированных цепей в соответствии с их размером. Некоторые будут длиннее других, в зависимости от того, где были включены специальные базы.

Существуют различные биохимические методы, которые позволяют разделять компоненты смеси, используя размер как дискриминационное свойство. В методе Сэнгера различные цепи разделяют электрофорезом. В самых сложных вариантах методики используется капиллярный электрофорез.

Таким образом, более длинные пряди движутся меньше, чем более короткие варианты. Затем эта система проходит через ридер, который распознает маркер, включенный в каждый дидезоксинуклеотид. Таким образом, порядок последовательности может быть известен.

Эта техника «первого поколения» способна считывать фрагменты ДНК размером не более 1 килобазы. В настоящее время метод Сангера используется в нескольких лабораториях, как правило, в его современных вариантах. Кроме того, он используется для подтверждения результатов, полученных с помощью самых сложных методов, но менее точных.

Автоматическая последовательность

Когда требуется крупномасштабное секвенирование, процесс ускоряется за счет автоматизации. Это вариант метода обрыва цепи Сангера, где праймеры помечены флуоресцентными продуктами, чтобы их можно было различить.

Впоследствии продукт реакции запускается в электрофорезе - все в одной полосе. Когда каждый фрагмент покидает последнюю часть геля, он быстро идентифицируется по флуоресцентной метке с ошибкой, которая составляет 1%..

Самые сложные системы имеют систему до 96 капиллярных трубок, управляемых компьютером, соединенным с роботом. То есть 96 образцов ДНК могут быть оценены одновременно. Таким образом, процесс, включающий электрофорез и анализ результатов, полностью автоматизирован.

За один день эти системы могут упорядочить до 550 000 баз. Во время процесса человеческая работа не нужна, запуск метода занимает всего около 15 минут.

Секвенирование Максам-Гилберт

В то же время, когда Сэнгер опубликовал свою работу, двум исследователям по имени Аллан Максан и Уолтер Гилберт удалось разработать другой метод получения последовательности ДНК. Метод приобрел популярность в то время, но позже был заменен улучшением метода Сэнгера..

В отличие от метода Сэнгера, секвенирование Максана и Гилберта (или химическое секвенирование, как оно также известно) не включает реакции гибридизации. Методология состоит из маркировки реакционноспособными агентами на одном конце с последующим процессом очистки.

Один из негативных аспектов этого метода заключается в его огромной сложности и в использовании химических веществ, которые опасны для пользователя. Химические нарушения вызваны применением DMS, муравьиной кислоты, гидразина и гидразина с солями.

процесс

Протокол начинается с маркировки на 5'-конце цепи с помощью фосфорного маркера 32, затем происходит химическая модификация азотистого основания, и оно отделяется. Наконец происходит расщепление абазической области.

Сначала последовательность, которую нужно упорядочить, укорачивается на более мелкие сегменты. Этот шаг выполняется с ферментами рестрикции, которые приводят к выдающимся крайностям.

Далее реакцию проводят с щелочной фосфатазой, целью которой является удаление фосфатной группы. Таким образом, полинуклеотидкиназа может быть использована для осуществления мечения.

Цепочка денатурирована (две нити открыты). Затем мы приступаем к применению химических веществ. Эти реакции расщепления проводятся контролируемым образом, и какие типы связей разрушаются каждым применяемым химическим веществом..

Чтение результатов

Как и в методе Сэнгера, считывание результатов включает разделение по размеру цепей, полученных в системе электрофореза. Системы, состоящие из полиакриламида, позволяют получить очень адекватное разрешение для считывания геля..

Массивная последовательность

Массивное секвенирование охватывает серию новых методов, сокращенно NGS, от английского "Следующее поколение ".

Методы, занесенные в каталог как NGS, требуют предварительного этапа амплификации ДНК (они не работают с одной молекулой). Кроме того, используемые платформы сильно различаются. Принципы наиболее популярных методов будут описаны ниже:

пиросеквенирование

Он включает в себя мониторинг высвобождения пирофосфата, который происходит каждый раз, когда новый нуклеотид добавляется к цепи ДНК. Ферментная система связана, так что излучение света (которое обнаруживается камерой) происходит каждый раз, когда вводится новый нуклеотид.

Процесс начинается с отдельной инкубации каждого азотистого основания, чтобы проверить, существует ли излучение света. Пиросеквенирование может выполнять чтение длинных цепей, но найденная частота ошибок высока.

Секвенирование по синтезу

Это включает в себя включение меченых нуклеотидов. Эти флуоресцентные компоненты добавляют, промывают и отмечают включенный нуклеотид. Затем маркировка нуклеотида устраняется, и синтез цепи может продолжаться. На следующем этапе также будет включен меченый нуклеотид, и упомянутые этапы будут повторены.

Недостаток этого метода заключается в том, что флуоресцентные маркеры не полностью устранены. Эти выбросы создают фоновые ошибки, что приводит к значительным ошибкам.

Секвенирование путем лигирования

Этот метод отличается от других, так как он не использует ДНК-полимеразу. Вместо этого ключевым ферментом для этой методологии является лигаза. Здесь используются фрагменты ДНК, флуоресцентно меченные, связанные ферментом и обнаруживаемые.

Самая большая проблема с этой техникой - очень короткая длина фрагмента, которая способна обрабатывать.

Ионный секвенирующий торрент

Этот метод основан на измерении иона Н+ который высвобождается каждый раз, когда новый нуклеотид включен. Принцип очень похож на пиросеквенирование, но гораздо дешевле.

примеров

Секвенирование генома человека

Секвенирование генома человека было одной из самых многообещающих задач в биологии, а также одним из самых известных конкурентов в истории науки. Фактически, для ученых, участвующих в проекте, секвенирование генома стало соревнованием..

В 1990 году он начал так называемый «проект генома человека», которым руководил известный ученый, лауреат Нобелевской премии Джеймс Уотсон. Через год, в 1991 году, Вентер взял на себя задачу «избить» Уотсона и установить последовательность генома перед ним. Однако в 1992 году Уотсон ушел в отставку, и команда была взята другим исследователем.

В 1995 году Вентер объявил о своем успехе в полном секвенировании бактериального генома методом случайного секвенирования. Аналогичным образом, противоположная команда объявила год спустя о секвенировании дрожжевого генома..

В 2000 году гонка была прекращена. Обе компании опубликовали свои предварительные результаты полного генома в двух самых престижных научных журналах: природа и наука.

Тем не менее, ученые продолжили работу над улучшением предложений, и в 2006 году были завершены последовательности определенных человеческих хромосом..

Важность и приложения

Знание порядка нуклеотидов молекулы, столь же важной, как ДНК, является ценным для биологов и связанных с ними специалистов. Эта цепочка полинуклеотидов содержит всю информацию, необходимую для развития и поддержания всех форм жизни.

По этим причинам знание этой последовательности необходимо для биологических исследований. По сути, секвенирование позволяет нам измерить одно из важнейших свойств биологических систем и установить различия между ними.

Секвенирование широко используется таксономистами и систематиками, поскольку определенные последовательности ДНК позволяют установить критерии для определения того, принадлежат ли два организма одному и тому же виду или нет, а также могут выдвигать гипотезы о филогенетических отношениях между ними..

Кроме того, секвенирование ДНК имеет приложения в области медицины и диагностики. Например, существуют доступные и доступные системы, которые посредством секвенирования позволяют нам оценить тенденцию развития определенных заболеваний (таких как рак) с использованием так называемых простых нуклеотидных полиморфизмов (SNP)..

Расследования криминалистического и криминалистического типа также были обогащены методами упорядочения и могут быть использованы в качестве надежного доказательства участия определенного лица в преступлении..

ссылки

  1. Хезер, Дж. М. и Чейн, Б. (2016). Последовательность секвенаторов: история секвенирования ДНК. Genomics, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K.M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Следующее поколение секвенирующей революции и ее влияние на геномику. клетка, 155(1), 27-38.
  3. Леви Дж. (2010). Научное соперничество. От Галилея до проекта генома человека. Paraninfo Редакция.
  4. Сэнгер Ф., Никлен С. и Коулсон А.Р. (1977). ДНК-секвенирование с цепочечными ингибиторами. Известия Национальной академии наук, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S.C. (2007). Секвенирование следующего поколения трансформирует современную биологию. Природные методы, 5(1), 16.
  6. Сюй, J. (ред.). (2014). Секвенирование следующего поколения. Caister Academic Press.