Характеристики протеиназы К, ферментативная активность и применение



протеиназа К представляет собой фермент, относящийся к группе сериновых протеаз, то есть он имеет в своем активном каталитическом центре аминокислоту серин и выполняет функцию разрыва пептидных связей путем гидролиза. В свою очередь этот фермент относится к семейству белков субтилизинов (пептидаза S8).

Протеиназа К имеет молекулярную массу (MW) 28 900 дальтон и была впервые выделена в 1974 году из экстрактов гриба. Альбом Engyodontium, ранее известный под именем Тритирахиум альбом Лимбер.

Он обладает высокой протеолитической способностью и способен разлагать кератин, присутствующий в волосах. Слово кератин на английском языке написано "кератин", следовательно, оно было названо "протеиназа К".

Из-за своей высокой способности расщеплять нативные белки этот фермент полезен в различных методах молекулярной биологии. Он в основном используется для выделения и приготовления нуклеиновых кислот с высокой молекулярной массой (МВт).

Протеиназа К действует, высвобождая ядерную ДНК, разрушая белки и инактивируя РНКазы и ДНКазы, то есть устраняет нуклеазы в препаратах ДНК и РНК..

С другой стороны, было видно, что протеиназа К может гидролизовать некоторые денатурированные нативные белки, что вызвало интерес исследователей к его использованию в исследовании прионных белков (PrPC).

Однако, несмотря на его высокую протеолитическую активность, существуют белки, которые устойчивы к действию протеиназы К. Среди них есть некоторые аномальные белки, называемые прионами (PrPSc), связанные с трансмиссивными губкообразными энцефалопатиями..

индекс

  • 1 Характеристика протеиназы К
  • 2 Ферментативная активность
  • 3 Приложения
  • 4 Преимущества протеиназы К
  • 5 Протеиназоустойчивые белки К
  • 6 Ссылки

Характеристики протеиназы К

Протеиназа К имеет третичную структуру, образованную тремя слоями, с β-листом из семи цепей, перемежающихся между двумя слоями спиралей. Поскольку он принадлежит к семейству пептидаз S8, он характеризуется наличием каталитической триады в своем активном сайте, чей последовательный порядок (Asp, His и Ser) отличает их от других семейств пептидаз..

Этот фермент из группы сериновых протеаз характеризуется гидролизом пептидных связей, близких к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот..

С другой стороны, он способен действовать в присутствии определенных едких веществ, таких как додецилсульфат натрия (SDS), трис-HCL и EDTA, которые используются для содействия денатурации белков, что приводит к потере их нативной структуры..

Это предварительный шаг в подготовке белков для метода электрофореза. Диапазон pH, в котором действует протеиназа K, довольно широк (от 2,0 до 12,0), с оптимальным pH от 7,5 до 12,0, а его изоэлектрическая точка составляет 8,9. Как можно заметить, он активен против очень широкого диапазона рН.

Другой характеристикой, которая выделяется в протеиназе К, является ее стабильность в присутствии высоких температур (50 - 60 ° С)..

Ферментативная активность

Протеиназа К нуждается в присутствии иона кальция, хотя это не влияет на ее активность, если это необходимо для поддержания ее стабильности.

Для протеиназы К для полного переваривания субстрата необходимо приблизительное время контакта от 5 минут до 2 часов..

Однако в этом смысле Даза и др. Сравнили чистоту ДНК, полученной при многократном воздействии протеиназы К, и пришли к выводу, что длительная инкубация (до 24 ч) значительно улучшает качество ДНК..

Теперь, что касается концентрации, которая используется для фермента протеиназы К в различных протоколах, можно сказать, что он очень разнообразен.

Его можно использовать от очень низких концентраций (5 мкг / мл) до концентраций 500 мкг / мл. Но наиболее частые рабочие концентрации находятся в диапазоне 50-100 мкг / мл, особенно для переваривания белков и инактивации нуклеаз. Хотя для лечения тканей требуется концентрация 2 мг / мл.

приложений

Его приложения очень широки и могут быть кратко изложены в следующем:

-Он используется для расщепления белка и выделения ДНК несколькими методами, такими как высаливание, PK-SDS, цетилтриметиламмонийбромид (ЦТАБ), модифицированный ацетат калия и экстракция йодидом натрия..

-Инактивация нуклеаз (РНКазы и ДНКазы).

-В методике гибридизации на месте (HIS), чтобы помочь высвободить нуклеиновую кислоту, в дополнение к устранению нежелательных белков.

-Модификация белка.

-На уровне исследований, в различных исследованиях.

Преимущества протеиназы К

Несколько сравнительных исследований были проведены среди методов выделения ДНК с использованием протеиназы К, с другими, которые не используют его, и все пришли к выводу, что есть большие преимущества при использовании фермента. Среди преимуществ можно отметить следующие:

-Получена высокомолекулярная ДНК высокого качества и чистоты..

-Извлеченная ДНК стабильна до 3 месяцев.

Извлеченную ДНК можно использовать в следующих методиках: саузерн-блот, полимеразная цепная реакция (ПЦР), электрофорез и др..

Белки, устойчивые к протеиназе К

Различные исследования пришли к выводу, что прионы (аномальные PrPSc-токсичные белки) отличаются от PrPC-белков (нативных), поскольку они устойчивы к действию протеиназы К, тогда как PrPC чувствительны к их действию..

Другие авторы описали, что в структуре PrPSc присутствуют чувствительные части, а другие устойчивы к протеиназе К. Однако обе части одинаково токсичны и инфекционны..

С другой стороны, Бастиан и его коллеги в 1987 году выделили 4 белка по 28, 30, 66 и 76 кДа из вида Спироплазма мирум. Все они были устойчивы к действию протеиназы К, а также имели перекрестную реакцию с некоторыми прионами..

Известно, что этот вид может вызывать катаракту и важные неврологические повреждения, и благодаря научным открытиям Бастиана, среди других исследований, была предпринята попытка связать этот микроорганизм с трансмиссивными губкообразными энцефалопатиями..

Однако этиология этой дегенеративной неврологической патологии до сих пор приписывается прионам.

В этом смысле Батлер и его коллеги в 1991 году идентифицировали и охарактеризовали класс белка K, устойчивого к 40-протеиназе, из двух штаммов Mycoplasma hyorhinis. Этот патоген поражает свиней, заражая их ткани, но в этом случае не было перекрестной реакции с тестируемыми прионами.

Необходимы дополнительные исследования, чтобы выяснить много неизвестных об этом.

ссылки

  1. Бастиан Ф., Дженнингс Р. и Гарднер В. 1987. Антисыворотка к скрепи-ассоциированному фибриллярному белку перекрестно реагирует с Спироплазма мирм белки фибрилл. J. Clin. Microbiol. 25: 2430-2431.
  2. Даза С, Гильен Дж, Кинг Дж, Руис В. Оценка метода выделения и очистки ДНК из мышечной ткани, фиксированной в формальдегиде, из неопознанных трупов.  Med Magazine, 2014; 22 (1): 42-49,
  3. Батлер Г., Котани Х., Конг Л., Фрик М., Эванчо С., Стэнбридж Э., Макгаррити Г. Идентификация и характеристика протеиназ К-резистентных белков у представителей класса Mollicutes. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Сравнение двух протоколов для извлечения ДНК из Трипаносома Крузи выращен в аксеновой среде. Преподобный Перу. Мед. Эксп. Общественное здравоохранение  2014; 31 (2): 222-227. Доступно по адресу: scielo.org
  5. Хименес Г., Вильялобос М., Хименес Е. и Пальма В. Определение эффективности пяти протоколов выделения ДНК из парафинового материала для молекулярных исследований. Преподобный Мед Univ Коста-Рика. 2007; 1 (1): 10-19.