Бактериальные характеристики мазка и подготовка
бактериальный мазок представляет собой удлинение в виде тонкой пленки суспензии бактериальных микроорганизмов, которую проводят на прозрачной стеклянной пластинке или предметных стеклах, для наблюдения под оптическим микроскопом.
Расширение в виде пленки выполняется для того, чтобы максимально разделить микроорганизмы, потому что, если они сгруппированы, наблюдение неясно.
При изучении бактериальных культур используются методы приготовления, фиксации и окрашивания мазка, чтобы лучше их проанализировать. Из-за небольшого размера микроорганизмов, для его наблюдения обязательно требуется использование оптического микроскопа..
Оптические микроскопы являются незаменимыми инструментами для наблюдения мазков. В них используются оптические линзы и свет, позволяющие визуализировать образцы с большим увеличением размера.
В целом, живые клетки не имеют структур, которые в основном окрашены, видимые через оптический микроскоп, они представляют собой бесцветные, прозрачные образцы и демонстрируют очень низкий внутренний контраст и окружение..
Наблюдение с помощью простого светового микроскопа, без использования вспомогательных методов окрашивания, очень ограничено и используется только в некоторых случаях, как при наблюдении за перемещением микроорганизмов..
Для оптимального наблюдения за микроорганизмами необходимо достичь баланса между контрастом и разрешением. Детали клеток нельзя наблюдать под микроскопом даже при высоком разрешении; использование красителей требуется с помощью методов окрашивания, которые обеспечивают контраст для наблюдения.
индекс
- 1 Характеристики хорошего качества бактериального мазка
- 1.1 Отличный контраст
- 1.2 Хорошее исправление
- 1.3 Хорошее окрашивание
- 2 Подготовка
- 2.1 А. Фротис
- 2.2 Б. Фиксация
- 2.3 C. Простое окрашивание
- 2.4 D. Окончательное сохранение мазка
- 3 Ссылки
Характеристики хорошего качества бактериального мазка
Отличный контраст
Для достижения отличного контраста существуют сложные микроскопы, называемые фазово-контрастный микроскоп, дифференциальный интерференционный и темнопольный микроскоп. Этот тип микроскопа используется для наблюдения за бактериальными структурами, такими как оболочки и нити, среди других.
Окрашивание - это простая техника для увеличения контрастности, которая достигается с помощью микроскопа в чистом поле. В этом методе могут использоваться различные красители, которые заметно улучшают наблюдение под микроскопом.
Пятна наносятся непосредственно на мазки или наросты суспензий микроорганизмов на предметных стеклах, предварительно высушенные и зафиксированные.
Хорошее исправление
Фиксация - это техника, которая используется для сохранения клеточных структур; вызывает инактивацию микроорганизмов и адгезию к стеклу предметного стекла. Существуют различные способы фиксации: термическая и химическая фиксация..
Тепловая фиксация
Этот метод наиболее часто используется при наблюдении бактериального мазка. Техника состоит в передаче бактериальной суспензии мазка пламенем зажигалки. Эта методика способна сохранить внешнюю морфологию бактерий, но разрушает их внутренние структуры.
Химическая фиксация
Химическая фиксация использует химические вещества в консервации, такие как формальдегид или формальдегид, этанол и уксусная кислота, среди других. Преимущество использования химических фиксирующих агентов состоит в том, что достигается сохранение внутренних клеточных структур микроорганизмов..
Хорошее окрашивание
Наиболее распространенными процедурами окрашивания предварительно высушенного и фиксированного мазка являются положительное или простое окрашивание, дифференциальное окрашивание и отрицательное окрашивание. Существуют также специальные методы окрашивания определенных клеточных структур (капсула, спора, жгутики)..
Положительное окрашивание или простое окрашивание
Позитивное или простое окрашивание является наиболее используемой техникой окрашивания пятен. Использует красители, которые обладают способностью связываться с определенными микробными структурами, что позволяет наблюдать их под микроскопом.
Эти красители имеют хромофорные группы (окрашенная часть) в своей химической структуре, с чередующимися двойными связями и простыми связями (сопряжение). Эти связи могут в свою очередь устанавливать ионные или ковалентные связи с некоторыми клеточными структурами.
Красители, используемые при положительном или простом окрашивании, в основном представляют собой химические производные анилин (цветные органические соли).
С другой стороны, среди красителей мы можем найти некоторые с базовым pH, а другие с кислотным pH..
Основные красители
У основных красителей хромофорная группа имеет положительный электрический заряд. Подавляющее большинство прокариотических микроорганизмов имеют нейтральный внутренний рН, а их клеточная поверхность заряжена отрицательно. Благодаря этому электростатическому взаимодействию хромофор связывается с клеткой и окрашивает ее.
Примерами основных красителей являются метиленовый синий, фиолетовый кристалл, малахитовый зеленый, основной фусцин, сафранин и другие..
Кислотные красители
В кислотных красителях хромофорная группа имеет отрицательный электрический заряд. Они используются для окрашивания белков с положительно заряженными аминогруппами. Примерами кислотных красителей являются кислота фусцин, роза бенгальская, конго красный и эозин.
Дифференциальное окрашивание
Техника дифференциального окрашивания состоит в нанесении двух красителей разного цвета или интенсивности, чтобы различать разные микроорганизмы под микроскопом. Окрашивание по Граму и кислотно-спиртовое окрашивание являются наиболее часто используемыми дифференциальными пятнами в бактериологии..
Окрашивание по Граму используется в качестве предварительного теста для определения формы, размера, группировки клеток, в дополнение к типу клеточной стенки. С помощью теста окраски по Граму бактерии с клеточной стенкой классифицируются как грамположительные бактерии и грамотрицательные бактерии..
Негативное окрашивание
В этом методе используются химические красители, которые не проникают внутрь клетки, но они делают так, чтобы среда, в которой микроорганизмы находились на черном фоне.
В технике негативного окрашивания мазок изготавливают с каплей суспензии китайских чернил или нигрозина, которая после высыхания при комнатной температуре образует пленку, непрозрачную для прохождения света. Таким образом, микроорганизмы наблюдаются как яркие формы на темном фоне.
подготовка
А. Мазок
1.- Вымойте слайды очень хорошо, высушите абсорбирующей бумагой и промаркируйте их. На этикетке должно быть указано содержание препарата, дата и имя лица, которое его обработало..
2.- Зажигайте зажигалку и стерилизуйте петлю для прививки в пламени, пока она не станет красной..
3.- Дайте ручке остыть.
4.- Возьмите пробирку с бактериальной культурой, снимите колпачок и быстро пропустите горловину пробирки рядом с пламенем зажигалки (пламя).
5.- Введите петлю инокуляции внутри пробирки с бактериальной культурой и возьмите образец.
6.- Если культура находится в жидкой среде, поместите образец, взятый с ручкой, в центр предметного стекла и аккуратно распределите его по кругу примерно 2 см в диаметре..
7.- Повторно стерилизовать цикл прививки.
8.- Разрешить высыхание мазка на воздухе.
9.- Повторите шаги с 3 по 8 три раза.
10.- Если культура находится в твердой среде, капля дистиллированной воды должна быть предварительно помещена на предметное стекло. Это делается для смешивания небольшого образца культуры, взятого с помощью рукоятки инокуляции, в соответствии с указаниями шагов 2–5 (условия асептики).
11.- Разведите разбавленный образец с каплей воды на предметном стекле и повторите три раза..
Б. Фиксация
1.- Добавьте к сухим мазкам, полученным из культур в жидкой среде, две капли метанола или абсолютного этанола..
2.- Разрешить сушку на воздухе вдали от зажигалки.
3.- Если мазок получен из культуры в твердой среде, сухой мазок фиксируют теплом, быстро пропуская его 2-3 раза через самую горячую область пламени зажигалки.
4.- Коснитесь нижней части мазка спинной частью левой руки (для правой руки, в противном случае используйте правую руку) и убедитесь, что она холодная.
C. Простое окрашивание
1.- Добавьте 2 капли выбранного красителя в мазок и дайте ему действовать в течение времени, требуемого в конкретных протоколах каждого красителя (обычно от 1 до 5 минут).
2.- Некоторые красители требуют использования тепла для их активации, и в этом случае необходимо быть очень осторожным при нагревании предметного стекла в пламени зажигалки (манипулируйте им с помощью пинцета и избегайте кипения). Перегрев мазка может разрушить клетки, которые вы хотите наблюдать.
3.- Удалите избыток красителя, промыв дистиллированной водой из пиктограммы. Удалите воду для стирки, осторожно постукивая по краю предметного стекла, наклоненного на рабочем столе..
4.- Разрешить воздушную сушку.
5.- В зависимости от типа наблюдения на этой стадии используется покровное стекло или нет. Покровное стекло защищает и сохраняет мазок. Если на этом этапе наблюдение проводится погружением в масло, покровное стекло не используется, но мазок не может быть сохранен..
D. Окончательное сохранение мазка
1.- Погрузите мазок последовательно в каждый из указанных ниже растворов, минимум на 5 минут. Целью этих «ванн» является полное обезвоживание мазка. Каждый реагент необходимо слить, прежде чем вводить мазок в следующую ванну.
Порядок дегидратирующих ванн следующий:
- Этанол 70%
- 95% этанол
- Чистый ацетон
- Смесь ацетон-ксилол 1: 1
- ксилол
Затем позвольте воздушной сушке.
2.- Установите покровное стекло, предпочтительно 22 × 22 мм, используя канадский бальзам или другие средства сборки..
ссылки
- Бриггс Г. (1965). Причинные факторы в микробиологических лабораторных авариях и инфекциях. Биологические лаборатории армии США. Форт Детрик.
- Капучино, J.G. и Уэлч, С.Т. (2017). Микробиология: лабораторное пособие. Pearson.
- Холт, J.G. Редактор. (1977). Краткое руководство Берги по детерминирующей бактериологии. 8го Балтимор: Уильямс и Уилкинс Ко.
- Джонсон, Т.Р. и дело; C.L. (2018). Лабораторные эксперименты по микробиологии. Pearson.
- Tille, P. (2017). Диагностическая микробиология. 14го Сент-Луис, США: Elsiever, Inc.