Основа, приготовление и использование мочевинного бульона

мочевинный бульон жидкая культуральная среда, используемая для демонстрации присутствия фермента уреазы в определенных микроорганизмах. Уреаза - это микробный фермент, который вырабатывается конститутивно, то есть он синтезируется независимо от того, присутствует ли субстрат, на который он действует,.

Функция уреазы связана с разложением органических соединений. Не все микроорганизмы способны синтезировать этот фермент, поэтому его определение в лаборатории позволяет идентифицировать определенные бактериальные штаммы и даже дифференцировать виды одного и того же рода..

Существует два типа анализа мочевины: Стюарт и Кристенсен. Они отличаются по своему составу и чувствительности. Первый - особый, чтобы показать большое количество уреазы, продуцируемой видами рода Proteus..

Второй является более чувствительным и может обнаруживать небольшие количества уреазы, генерируемой позднее другими бактериальными родами, такими как клебсиелла, энтеробактер, стафилококк, бруцелла, бордетелла, бацилла, микрококк, хеликобактер и микобактерия..

Мочевина бульона Стюарт состоит из мочевины, хлорида натрия, дикалийфосфата, монокалийфосфата, дрожжевого экстракта, фенолового красного и дистиллированной воды..

Принимая во внимание, что бульон Кристенсена или агар мочевины состоит из пептонов, хлорида натрия, монокалийфосфата, глюкозы, мочевины, фенолового красного, дистиллированной воды и агар-агара. Последний, только если это твердая среда.

индекс

• 1 фундамент
  • 1.1 бульон мочевины Stuart
  • 1,2 бульона Кристенсена или агара с мочевиной
  • 1.3 Интерпретация обоих СМИ (Стюарт и Кристенсен)
• 2 Подготовка
  • 2.1 бульон мочевины Stuart
  • 2.2 Кристенсен бульон или агар мочевина
• 3 использования
• 4 Посев мочевины
• 5 Контроль качества
• 6 Ссылки

фундамент

Фермент уреаза гидролизует мочевину с образованием углекислого газа, воды и двух молекул аммиака. Эти соединения реагируют с образованием конечного продукта под названием карбонат аммония.

Бульон мочевины Stuart

Мочевина бульона Стюарта более забуферена с рН 6,8. Следовательно, микроорганизм должен быть способен образовывать большое количество аммония, чтобы стать красным до фенола. РН должен подниматься выше 8.

Поэтому мочевинный бульон Стюарта является селективным для видов Proteus, давая положительные результаты в течение 24-48 часов инкубации, и не эффективен для бактерий, которые производят небольшое количество уреазы или которые медленно гидролизуют мочевину..

Это потому, что виды Proteus могут использовать мочевину в качестве источника азота. Напротив, другим уреаз-продуцирующим бактериям нужен дополнительный источник.

Тем не менее, Перес и соавт. (2002) определили, что мочевинный бульон Стюарта был так же эффективен, как и мочевинный агар от Кристенсена, для определения уреазы в штаммах дрожжей родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon и Saccharomyces..

Авторы исследования утверждают, что достигли 100% совпадения с обоими средами (Стюарт и Кристенсен) путем инкубации в течение 24 и 48 часов; при условии, что они положительно восприняли штаммы, которым удалось превратить СМИ в ярко-розовый цвет фуксии.

Это уточнение необходимо, поскольку Лоддер (1970) подтвердил, что почти всем дрожжам удается поместить скат мочевинного агара Кристенсена в бледно-розовый цвет. Это потому, что они могут гидролизовать мочевину в минимальных количествах и образовывать амины путем окислительного декарбоксилирования аминокислот на поверхности. Это не должно быть истолковано как положительное.

Бульон или мочевинный агар от Кристенсена

Кислотный бульон или агар Кристенсена менее забуферен и способен обнаруживать небольшие количества аммония. Кроме того, эта среда обогащена пептонами и глюкозой. Эти соединения вызывают развитие других продуцирующих уреазу микроорганизмов, которые не растут в бульоне Стюарта..

Аналогично, тест на мочевину Кристенсена дает более быстрые результаты, особенно для Протеуса, и дает возможность получить положительный результат всего за 30 минут за минимальное время и до 6 часов за максимальное время.

Остальным микроорганизмам, продуцирующим уреазу, удается слегка изменить цвет среды через 6 часов и сильно через 24, 48, 72 часа или более, и даже некоторые штаммы могут давать слабые реакции через 5 или 6 дней..

Интерпретация обоих СМИ (Стюарт и Кристенсен)

Среда изначально имеет желто-оранжевый цвет, и положительная реакция превратит цвет среды в розово-фуксию. Интенсивность цвета прямо пропорциональна количеству производимого аммония.

Отрицательная реакция оставит носитель исходного цвета, за исключением дрожжей, которые могут дать бледно-розовый с мочевинным агаром Кристенсена.

подготовка

Бульон мочевины Stuart

Взвесьте необходимые граммы по указанию торгового дома. Растворить в предпочтительно стерильной дистиллированной воде. Не используйте тепло для растворения, потому что мочевина чувствительна к теплу.

Метод мембранной фильтрации используется для стерилизации. Для этого используется фильтр Millipore с порами диаметром 0,45 мкм. Не используйте автоклав. После того как раствор отфильтрован, его распределяют в стерильных пробирках. Чтобы получить достоверные результаты, его необходимо перевести от 1,5 мл как минимальное количество до 3 мл как максимальное количество на пробирку..

Хранить в холодильнике и выдерживать перед использованием.

Если метод фильтрации недоступен, среду следует использовать немедленно, чтобы получить надежные результаты.

Еще один способ приготовления мочевины бульона Стюарта заключается в следующем:

Некоторые коммерческие дома продают половину основания для теста на мочевину, не включая мочевину.

Сумма, указанная коммерческим домом, взвешивается. Его растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют в автоклаве при 121 ° С в течение 15 минут. Дайте ему немного отдохнуть, и когда среда станет теплой, добавьте 100 мл раствора мочевины, приготовленного на 20% и стерилизованного фильтрованием..

Он распространяется в стерильных пробирках, как описано ранее.

Бульон или мочевинный агар от Кристенсена

-Приготовление раствора мочевины

Взвесьте 29 граммов обезвоженной мочевины и растворите в 100 мл дистиллированной воды. Используйте метод фильтрации для стерилизации. Не автоклавировать.

-Мочевина базовый агар

Растворите 24 г обезвоженного основного агара в 950 мл дистиллированной воды. Стерилизовать в автоклаве при 121 ° С в течение 15 минут. Дайте постоять, пока он не достигнет температуры 50 ° C, и добавьте предварительно подготовленную мочевину в асептических условиях.

Налейте от 4 до 5 мл в стерильные пробирки и наклоните до затвердевания. Там должен быть длинный пик флейты.

Эта среда также может быть приготовлена ​​в жидком виде.

приложений

Тест на мочевину чрезвычайно эффективен при различении рода Proteus от других родов семейства Enterobacteriaceae, учитывая быструю реакцию, обеспечиваемую Proteus.

Если используется состав Christensen, тест помогает различать виды одного и того же рода. Например, S. haemolyticus и S. warneri sна стафилококк коагулаза отрицательный и бета-гемолитический, но они отличаются в этом S. haemolyticus это отрицательная мочевина и S. warneri это положительная мочевина.

С другой стороны, McNulty успешно использовал 2% мочевинный бульон Кристенсена для изучения наличия Helicobacter pylori в образцах биопсии, взятой из слизистой оболочки желудка (антральный отдел).

Наличие H. pylori это подтверждается положительным тестом на мочевину. Продолжительность наблюдения за результатами прямо пропорциональна количеству присутствующих микроорганизмов..

Как видно, это простой метод диагностики Helicobacter pylori при биопсии желудка.

Наконец, этот тест также полезен для дифференциации видов родов Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus и Mycobacteria..

Посев мочевины

Два метода требуют сильного микробного инокулята для оптимизации результатов. Бактериальные колонии предпочтительно отбирают из кровяного агара и сабуро-агара, за некоторыми исключениями. Инокулят эмульгируется в жидкой среде.

Для мочевинного бульона Стюарта инкубируют при 37 ° С в течение 24-48 часов, зная, что искать штаммы рода Proteus можно только в том случае, если штамм является бактерией. Для дрожжей его можно инкубировать при 37 ° C или при комнатной температуре в течение 24–48 часов инкубации..

В случае мочевинного бульона Кристенсена инкубировать при 37 ° С в течение 24 часов. Если тест отрицательный, его можно инкубировать до 6 дней. Если тест положительный до 6 часов, это указывает на то, что это штамм рода Proteus.

В случае мочевинного агара Christensen скос агара сильно инокулируется, без прокалывания. Бульон инкубируют и интерпретируют таким же образом.

Контроль качества

Контрольные штаммы могут быть использованы для тестирования среды, такие как Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Кишечная палочка ATCC 25922 и Salmonella typhimurium.  Первые два должны дать положительные результаты, а последние два - отрицательные..

ссылки

1. Перес С, Гойтия К., Мата С, Хартунг С, Колелла М, Рейес Н. и другие. Использование мочевинного бульона Стюарта для теста на уреазу, в качестве теста при диагностике дрожжей. Rev. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Доступно по адресу: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Биохимические тесты для выявления бактерий, имеющих клиническое значение. 3-е изд. Редакция Panamericana. Буэнос-Айрес Аргентина.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Микробиологическая диагностика Бэйли и Скотта. 12 изд. Редакция Panamericana S.A. Аргентина.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Микробиологический диагноз. 5-е изд. Редакция Panamericana S.A. Аргентина.
5. Лаборатории Британии. Кристенсен Медио (Мочевина агар база) 2015. Доступно по адресу: britanialab.com