Функции рестрикционных ферментов, механизм действия, типы и примеры.

ферменты рестрикции они являются эндонуклеазами, используемыми некоторыми археями и бактериями для подавления или «ограничения» распространения вирусов внутри них. Они особенно распространены у бактерий и являются частью их системы защиты от чужеродной ДНК, известной как система ограничения / модификации..

Эти ферменты катализируют разрезание двухцепочечной ДНК в определенных местах, воспроизводимо и без использования дополнительной энергии. Большинство требуют присутствия кофакторов, таких как магний или другие двухвалентные катионы, хотя некоторые также требуют АТФ или S-аденозилметионина.

Эндонуклеазы рестрикции были открыты в 1978 году Дэниелом Натансом, Арбером Вернером и Гамильтоном Смитом, которые получили Нобелевскую премию по медицине за их открытие. Его название обычно происходит от организма, где они наблюдаются впервые.

Такие ферменты широко используются при разработке методов клонирования ДНК и других стратегий молекулярной биологии и генной инженерии. Его характеристики распознавания специфических последовательностей и способность разрезать последовательности рядом с сайтами распознавания делают их мощными инструментами в генетических экспериментах..

Фрагменты, сгенерированные рестрикционными ферментами, которые воздействовали на определенную молекулу ДНК, можно использовать для воссоздания «карты» исходной молекулы, используя информацию о местах, где фермент режет ДНК..

Некоторые рестриктазы могут иметь один и тот же сайт узнавания в ДНК, но они не обязательно обрезают его одинаковым образом. Таким образом, существуют ферменты, которые делают разрезы, оставляя тупые концы, и ферменты, которые делают разрезы, оставляя когезивные концы, которые имеют различные применения в молекулярной биологии..

В настоящее время существуют сотни различных коммерчески доступных ферментов рестрикции, предлагаемых различными коммерческими фирмами; эти ферменты работают как «обычные» молекулярные ножницы для разных целей.

индекс

• 1 Функции
• 2 Механизм действия
• 3 типа
  • 3.1 Тип I рестриктазы
  • 3.2 Тип II рестриктазы
  • 3.3 Тип III рестриктазы
  • 3.4 Рестрикционные ферменты типа IV
  • 3.5 Рестрикционные ферменты типа V
• 4 примера
• 5 ссылок

функции

Ферменты рестрикции выполняют противоположную функцию полимераз, поскольку они гидролизуют или разрушают сложноэфирную связь внутри фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами в нуклеотидной цепи..

В молекулярной биологии и генной инженерии они широко используют инструменты для конструирования векторов экспрессии и клонирования, а также для идентификации конкретных последовательностей. Они также полезны для конструирования рекомбинантных геномов и имеют большой биотехнологический потенциал..

Последние достижения в генной терапии позволяют в настоящее время использовать ферменты рестрикции для введения определенных генов в векторы, которые являются носителями для транспорта таких генов в живые клетки и которые, вероятно, способны вставляться в геном клетки для осуществления постоянные изменения.

Механизм действия

Рестрикционные ферменты могут катализировать разрезание двухцепочечной ДНК, хотя некоторые способны распознавать одноцепочечные последовательности ДНК и даже РНК. Разрез происходит после распознавания последовательностей.

Механизм действия заключается в гидролизе фосфодиэфирной связи между фосфатной группой и дезоксирибозой в основной цепи каждой цепи ДНК. Многие из ферментов могут разрезать в том же месте, которое они распознают, в то время как другие перерезают от 5 до 9 пар оснований до или после него..

Обычно эти ферменты резают на 5'-конце фосфатной группы, образуя фрагменты ДНК с 5'-фосфорильным концом и концевым 3'-гидроксильным концом.

Поскольку белки не вступают в прямой контакт с сайтом узнавания в ДНК, они должны быть последовательно перемещены до тех пор, пока не достигнут конкретного сайта, возможно, посредством «скользящих» механизмов на цепи ДНК..

Во время ферментативного разрезания фосфодиэфирная связь каждой из цепей ДНК расположена в одном из активных сайтов рестрикционных ферментов. Когда фермент покидает сайт распознавания и разрезания, он делает это через неспецифические переходные ассоциации.

тип

В настоящее время известно пять типов ферментов рестрикции. Ниже краткое описание каждого:

Рестриктазы типа I

Эти ферменты представляют собой большие пентамерные белки с тремя субъединицами, ограничением, метилированием и другим для распознавания последовательностей в ДНК. Эти эндонуклеазы представляют собой многофункциональные белки, способные катализировать реакции рестрикции и модификации, они обладают АТФазной активностью, а также ДНК-топоизомеразой..

Ферменты этого типа были первыми эндонуклеазами, которые были открыты, они были впервые очищены в 1960-х годах, и с тех пор их изучали с большой глубиной..

Ферменты типа I не используются широко в качестве биотехнологического инструмента, поскольку участок резки может находиться на переменном расстоянии до 1000 пар оснований от сайта распознавания, что делает их ненадежными с точки зрения воспроизводимости эксперимента..

Рестриктазы типа II

Они представляют собой ферменты, состоящие из гомодимеров или тетрамеров, которые разрезают ДНК в определенных сайтах длиной от 4 до 8 п.н. Эти места резания обычно являются палиндромными, то есть они распознают последовательности, которые считываются одинаково в обоих направлениях..

Многие из ферментов рестрикции типа II в бактериях разрезают ДНК, когда они распознают свой чужеродный характер, поскольку они не обладают типичными модификациями, которые должна иметь собственная ДНК..

Это простейшие рестрикционные ферменты, так как им не требуется никакого кофактора, кроме магния (Mg +), для распознавания и разрезания последовательностей ДНК..

Точность ферментов рестрикции типа II в распознавании и разрезании простых последовательностей в ДНК в точных положениях делает их одними из наиболее используемых и незаменимых в большинстве отраслей молекулярной биологии..

Внутри группы ферментов рестрикции типа II имеется несколько подклассов, классифицированных в соответствии с определенными свойствами, которые являются уникальными для каждого из них. Классификация этих ферментов осуществляется путем добавления букв алфавита от А до Z, следующих за названием фермента..

Некоторые из подклассов, наиболее известных своей полезностью:

Подкласс IIA

Это димеры разных субъединиц. Они распознают асимметричные последовательности и используются в качестве идеальных предшественников для генерации режущих ферментов..

Подкласс IIB

Они состоят из еще одного димера и разрезают ДНК с обеих сторон последовательности распознавания. Они разрезали обе цепи ДНК в диапазоне пар оснований за пределами сайта узнавания.

Подкласс IIC

Ферменты этого типа представляют собой полипептиды с функциями деления и модификации цепей ДНК. Эти ферменты асимметрично разрезали обе цепи.

Подкласс IIE

Ферменты этого подкласса наиболее широко используются в генной инженерии. Они имеют каталитический сайт и обычно требуют аллостерического эффектора. Эти ферменты должны взаимодействовать с двумя копиями их последовательности распознавания, чтобы сделать эффективный разрез. Внутри этого подкласса находятся ферменты EcoRII и EcoRI.

Рестриктазы типа III

Эндонуклеазы рестрикции типа III состоят только из двух субъединиц, одна отвечает за распознавание и модификацию ДНК, а другая отвечает за разрезание последовательности.

Эти ферменты требуют два кофактора для их функционирования: АТФ и магния. Рестрикционные ферменты этого типа обладают двумя асимметричными сайтами распознавания, транслоцируют ДНК АТФ-зависимым образом и обрезают ее между 20 и 30 п.н. рядом с сайтом распознавания..

Рестриктазы типа IV

Ферменты типа IV легко идентифицировать, поскольку они разрезают ДНК метилирующими метками, они состоят из нескольких различных субъединиц, которые отвечают за распознавание и разрезание последовательности ДНК. Эти ферменты используют в качестве кофакторов ГТФ и двухвалентного магния.

Конкретные сайты для разрезания включают нуклеотидные цепи с остатками метилированного или гидроксиметилированного цитозина в одной или обеих цепях нуклеиновых кислот.

Рестриктазы типа V

Эта классификация группирует ферменты типа CRISPER-Cas, которые идентифицируют и отрезают определенные последовательности ДНК от инвазивных организмов. В ферментах Cas используется цепь синтезированной направляющей РНК CRISPER для распознавания и нападения на вторгающиеся организмы..

Ферменты, классифицируемые как тип V, представляют собой полипептиды, структурированные ферментами типа I, II и II. Они могут разрезать участки ДНК практически любого организма и с большим диапазоном длины. Их гибкость и простота использования делают эти ферменты одним из наиболее часто используемых инструментов в генной инженерии сегодня наряду с ферментами II типа..

примеров

Рестрикционные ферменты использовались для обнаружения полиморфизмов ДНК, особенно в исследованиях популяционной генетики и эволюционных исследованиях с использованием митохондриальной ДНК, чтобы получить информацию о скоростях нуклеотидных замен..

В настоящее время векторы, используемые для трансформации бактерий различного назначения, имеют сайты с множественной болью, в которых обнаруживаются сайты узнавания для множества рестрикционных ферментов..

Среди этих ферментов наиболее популярными являются EcoRI, II, III, IV и V, полученные и описанные впервые Кишечная палочка; HindIII, из H. influenzae и BamHI's B. amyloliquefaciens.

ссылки

1. Bickle, T.A., & Kruger, D.H. (1993). Биология рестрикции ДНК. Микробиологические обзоры, 57(2), 434-450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A. & Horvath, P. (2007). CRISPR обеспечивает приобретенную устойчивость к вирусам у прокариот. наука, 315(Март) 1709-1713.
3. Goodsell, D. (2002). Молекулярная перспектива: эндонуклеазы рестрикции. Основы стволовых клеток раковой медицины, 20, 190-191.
4. Halford, S.E. (2001). Прыжки, прыжки и петли с помощью ферментов рестрикции. Биохимическое общество Сделки, 29, 363-373.
5. Ельч А. (2003). Поддержание видовой идентичности и контроль видообразования бактерий: новая функция для систем ограничения / модификации? ген, 317, 13-16.
6. Кребс Дж., Гольдштейн Э. и Килпатрик С. (2018). Гены Левина XII (12 изд.). Берлингтон, Массачусетс: Джонс и Бартлетт Лирнинг.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... She, Q. (2015). Использование систем CRISPR-Cas типа I и типа III для редактирования генома. Исследование нуклеиновых кислот, 1-12.
8. Loenen, W. A.M., Dryden, D.T.F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). Ферменты рестрикции типа I и их родственники. Исследование нуклеиновых кислот, 1-25.
9.  Натанс Д. и Смит Х. О. (1975). Эндонуклеазы рестрикции в анализе и перестройке молекул ДНК. Annu. Преподобный Биохим., 273-293.
10.  Nei, M. & Tajima, F. (1981). ДНК-полиморфизм, определяемый рестрикционными эндонуклеазами. генетика, 145-163.
11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. & Wende, W. (2005). Клеточные и молекулярные рестрикционные эндонуклеазы II типа: структура и механизм. CMLS Клеточные и молекулярные науки о жизни, 62, 685-707.
12.  Робертс Р. (2005). Как ферменты рестрикции стали рабочими лошадками молекулярной биологии. PNAS, 102(17), 5905-5908.
13.  Робертс Р. Дж. И Мюррей К. (1976). Рестрикционные эндонуклеазы. Критические обзоры в биохимии, (Ноябрь), 123-164.
14.  Стоддард, Б. Л. (2005). Структура и функция эндонуклеазы Хоминг. Ежеквартальные обзоры биофизики, 1-47.
15.  Tock, M.R. & Dryden, D.T.F. (2005). Биология ограничения и антирестрикции. Современное мнение в микробиологии, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16.  Wilson, G.G. & Murray, N.E. (1991). Системы ограничения и модификации. Annu. Преподобный Генет., 25, 585-627.
17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Геномное понимание вирулентности Campylobacter jejuni и популяционной генетики. Infect. Дис. Перев. Med., 2(3), 109-119.
18.  Юань Р. (1981). Структура и механизм полифункциональных рестрикционных эндонуклеаз. Annu. Преподобный Биохим., 50, 285-315.